hirdetés
hirdetés
2022. október. 07., péntek - Amália.
hirdetés

Gyorsabb, biztosabb antibiotikum-érzékenységi vizsgálatok

Klasszikus és új laboratóriumi módszerek a gyakorlatban

A fertőzések kórokozóinak identifikálása, antibiotikum-érzékenységének meghatározása rutinesetben 24–72 órát is igénybe vehet. Ez alatt a klinikus empirikusan kezel a feltételezett patogén ellen, a helyi epidemiológiai adatok ismeretében.

hirdetés

Számos vizsgálat igazolta, hogy az időben alkalmazott adekvát terápia szignifikánsan növeli a betegek túlélési esélyeit, csökkentheti a költségeket (kevesebb laboratóriumi vizsgálat kérése, rövidebb ápolási idő), valamint a rezisztens mikrobák szelektálódásának és elterjedésének esélyét is (1). Az érzékenységi eredmények meghatározására a mikrobiológiai laboratóriumoknak számos új, gyors eredményt adó vizsgálati eljárást kell beépíteniük a rutinmunkába, amelyek napjainkban főleg a multirezisztens mikrobák mielőbbi azonosítását célozzák.

Fenotípusos rezisztenciavizsgálatok        

Automata rendszerekkel végzett rezisztenciavizsgálatok során a baktérium szaporodásának optikai (turbidimetriás és kolorimetriás) mérését végezzük az antibiotikum jelenlétében. Előny, hogy pontos MIC-értéket (minimális gátlókoncentráció) is meg tudunk határozni, a szükséges idő 3,5–16 órára csökkenthető (2). Egyes rezisztenciamechanizmusoknál vagy biofilmképző, esetleg lassan növő mikrobáknál nem kapunk korrekt értéket (MIC-érték korrelálása a referens módszerrel ~90 százalék).

Szükség lehet speciális rezisztenciamechanizmusok direkt kimutatására, amelyeket általában inhibitoros alapú, fenotípusos tesztekkel végzünk, így időigényük egy nap (3). Az antibiotikumot bontó enzimet jól expresszáló baktériumok eseteiben alkalmazhatók a szubsztrátot (antibiotikum és/vagy gátlószer) és indikátort együtt használó tesztek, amelyek időigénye 10 perc–3 óra. Ilyenek például a kereskedelmi forgalomban megvásárolható, a harmadik generációs cefalosporinokra való rezisztenciát kimutató tesztek (például β-lacta teszt). A pontos rezisztenciamechanizmust nem tudjuk [lehet ESBL (extended spectrum β-lactamase: kiterjedt spektrumú β-laktamáz) vagy AmpC túltermelése], de pozitivitás esetén egyes cefalosporinok biztosan nem használhatók. Alkalmazható pozitív hemokultúrából direkt módon is. Napjainkban a nagy kihívást jelentő karbapenemáztermelő baktériumok minél előbbi kiszűrése terápiás és epidemiológiai jelentősége miatt is fontos. Használható a már kereskedelmi forgalomban is kapható Carba-NP teszt. Leírták alkalmazhatóságát pozitív hemokultúrából is, illetve egyre több típusú mikrobára validálva (bélbaktériumok, nem fermentálók) (4). Tudnunk kell azonban, hogy nem mutat ki minden típusú karbapenemázt, így például a hazánkban is egyre gyakoribb OXA-48 típusúaknál más módszert kell választanunk. Érzékenyebbnek tűnik a karbapeneminhibitoros teszt (CIM), amely megfelelően kontrollálva szintén jól beépíthető a napi rutinba (5).

Egyre több latexagglutinációs vagy immunokromatográfiás gyorsteszt jelenik meg a kereskedelmi forgalomban a problémát jelentő rezisztenciamechanizmusok (pl. OXA-48, KPC) kimutatására, amelyeket a kitenyészett izolátumokban igazolhatunk. A napi rutinban azokat célszerű alkalmazni, amelyek hazánkban gyakoriak; ismerni kell az érzékenységüket és a validitásukat [a hagyományos mecA gén terméke, a PBP2a kimutatásán alapuló tesztekkel a mecC-termelő MRSA-kat (meticillinrezisztens Staphylococcus aureus) nem tudjuk kimutatni].

MALDI-TOF MS        

Az izolált mikrobák identifikálását forradalmasította a hazánkban egyre több helyen elérhető MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry). Igen kis mintamennyiségből is indítható a vizsgálat (10’4 CFU/ml), így kritikus esetben sokszor már a rövidebb tenyésztési idő után megjelenő, alig látható izolált telepek vizsgálatával legalább a tenyésző mikroba faját közölni lehet a kezelőorvossal. A faj és így a természetes rezisztencia ismerete optimalizálhatja a terápiát. Gyorsaságuk miatt számos kutatás folyik arra, hogy meghatározzák, a MALDI-TOF MS rendszerek alkalmazhatók-e antibiotikum-érzékenység meghatározására. Az egyik lehetőség speciális rezisztenciájú baktériumok elkülönítése a klonalitás alapján [például MRSA/MSSA; VRE/nem VRE (vancomycinrezisztens Enterococcus) izolátumok – tömegspektrogramjának jellemző különbségei]. Régóta folynak kísérletek a módszer alkalmazására „valós” antibiotikum-érzékenység megadására. Ha a vizsgálandó baktériumot és antibiotikumot rövid ideig együtt tenyésztjük, a szubsztrát (antibiotikum) spektruma megváltozik a hidrolizáló, dekarboxiláló enzimek hatására, ami tömegspektrométeres vizsgálattal detektálható. A módszer előnye, hogy rövid idő alatt (1–4 óra) eredményt kaphatunk, az eredményt nem befolyásolja a genetikai háttér (pl. mindegy, hogy milyen típusú ESBL- vagy karbapenemáztermelő a baktérium), a kapott eredmény fenotípusos, a hagyományos diffúziós vagy dilúciós módszerekkel összevethető (6, 7).

Molekuláris módszerek

Lehetőség van izolátumok speciális rezisztenciamechanizmusainak genetikai hátterét kimutató molekuláris vizsgálatokra, akár kereskedelmi forgalomban kapható, akár megfelelően validált „home made” módszerekkel: pl. mecA, vanA, CTX-M15, egyes karbapenemáz enzimek. Jelenleg az IVD-s tesztek alkalmazhatóságának az áruk szab határt. Ugyanakkor érthető az igény a klinikum felől, hogy megoldható legyen az antimikrobás rezisztenciáért felelős gének kimutatása is az identifikálás mellett, közvetlenül a klinikai mintákból. Ez akkor lehetséges, ha „biztos” összefüggés van a gén jelenléte és a fenotípusos rezisztencia között (például mecA/MRSA, vanA/VRE). Kromoszomális rezisztenciagének kapcsolhatók az identifikáláshoz, plazmidosak nem. Tudnunk kell azt is, hogy a nem steril helyről származó klinikai minta hamis eredményt adhat nem megfelelő tesztet választva (8).

Molekuláris vizsgálatok körében számos izgalmas fejlesztés várható.RT-PCR alkalmazásával lehetőség van rezisztenciamechanizmustól független fenotípusos rezisztenciamérésre: antibiotikum jelenlétében tenyésztve a baktériumot rövid inkubációs idő után a fajra specifikus nukleinsav pontos, kvantitatív mennyiségi mérésével. A teljes genom szekvenálásával kapható eredményekhez szükséges idő a technika fejlődésével rövidül, azonban a kapott eredmények értékeléséhez jelentős bioinformatikai tudásra lesz szükség. A microarray-rendszerek, amelyek specifikus nukleinsav-szekvenciák kimutatását végzik komplementer oligonukleotidokkal, igen specifikus, szenzitív (10–100 kópia kimutatására alkalmas) módszerek. Számos (~ezer) szekvencia vizsgálható egy assay-ben – egy nap alatt. Ideális lehet olyan baktériumok vizsgálatára, amelyekben számos rezisztenciagén van. A nanotechnológiai fejlesztések révén a mikrofluidikai módszerek segítségével lehetővé vált a molekuláris vizsgálatok miniatürizálása. Akár pikoliter mennyiségben, egy rendszerben végezhető a baktérium tenyésztése, a nukleinsav hibridizációja, amplifikációja, majd az elektrokémiai/mágneses/optikai detektálás. A méréssel 4–6 óra alatt körülbelüli MIC-értéket határozhatunk meg. A fejlesztések a „point of care” vizsgálatok lehetőségével kecsegtetnek. Ígéretesek a sejtlízisalapú technikák is. Választott koncentrációjú antibiotikummal együtt tenyésztve a baktériumot, majd agaróz mikrogélre átvive a sejtek lizálása után kell a baktérium-DNS intaktságát vizsgálni fluoreszcens festés után. Fenotípusos érzékenységi eredmény, akár MIC-érték is meghatározható (9).

Összegzés

Tudásunk és lehetőségeink szerint kombinálva kell alkalmazni az új és a klasszikus, tenyésztéses módszereket a gyors, korrekt antibiotikum-érzékenységi eredményekhez. Ismernünk kell az egyes vizsgálatok értékeit, és megfelelően kell tudni interpretálni. A csak a már ismert rezisztenciamechanizmusok kimutatását célzó molekuláris vizsgálatok nem helyettesíthetik az antimikrobás érzékenységi vizsgálatokat, terápia nem alapulhat negatív molekuláris eredményen, hiszen új variánsok így nem detektálhatók, illetve nem minden esetben ismert a genetikai háttér. A rezisztenciáért felelős gén jelenléte viszont nem feltétlenül jelent fenotípusos rezisztenciát (nem expresszálódik a gén a részleges génváltozás miatt). Bármilyen módszert is alkalmazunk azonban, a legfontosabb a kommunikáció, minden, a terápiát befolyásoló (rész)eredmény közlése.

 Irodalom

1. Livermore DM, Wain J. Revolutionising bacteriology to improve treatment outcomes and antibiotic stewardship. Infect Chemother 2013;45(1):1–10

2. Gherardi G, Angeletti S, Panitti M, et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagn Microbiol Infect Dis 2012;72(1):20–31.

3. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. www.eucast.org/EUCAST_detection_of_resistance_mechanisms_v1.0_20131211(2)

4. Nordmann P, Poirel L, Dortet L. Rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis 2012;18(9):1503–7.

5. van der Zwaluw K, de Haan A, Pluister GN, et al. The carbapenem inactivation method (CIM), a simple and low-cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in gram-negative rods. PLoS One. 2015;23;10(3):e0123690.

6. Bizzini A, Greub G. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, a revolution in clinical microbial identification. Clin Microbiol Infect 2010;16:1614–9.

7. Wieser A, Schneider L, Jung J, Schubert S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl Microbiol Biotechnol 2012;93:965–74.

8. A van Belkum A, Durand G, Peyret M, et al. Rapid clinical bacteriology and its future Impact. Ann Lab Med 2013;33:14–27.

9.Caliendo AM, Gilbert DN, Ginocchio CC, et al; for the Infectious Diseases Society of America (IDSA): Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. CID 2013;57 (Suppl 3) S139–170.

Dr. Kristóf Katalin, Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Laboratórium
a szerző cikkei

(forrás: Medical Tribune)
hirdetés
Olvasói vélemény: 0,0 / 10
Értékelés:
A cikk értékeléséhez, kérjük először jelentkezzen be!
hirdetés